…ного броже­ния выделяются на поверхности сбраживаемой среды в виде довольно толстого слоя пены и остаются в таком состоянии до окончания брожения. Затем они оседают, но редко дают плот­ный осадок на дне бродильного сосуда. Дрожжи верхового брожения по своей структуре принадлежат к пылевидным дрож­жам, не склеивающимся друг с другом в отличие от хлопьевид­ных дрожжей низового брожения, оболочки которых являются клейкими, что приводит к агглютинации и быстрому осаждению клеток.

Дрожжи низового брожения, развиваясь в сбраживаемой жидкости, не переходят в поверхностный слой – пену, быстро оседают по окончании брожения, образуя плотный слой на дне бродильного сосуда.

Отличительным признаком является способность дрожжей низового брожения полностью сбраживать рафинозу, тогда как большинство дрожжей верхового брожения рафинозу совершен­но не расщепляет, и лишь некоторые виды могут сбраживать ее только на одну треть. Это основное различие объясняется тем, что в ферментном комплексе названного типа дрожжей содер­жится α-галактозидаза.

Из культурных дрожжей к дрожжам низового брожения от­носится большинство винных и пивных дрожжей, а к дрожжам верхового брожения – спиртовые, хлебопекарные и некоторые расы пивных дрожжей. Первоначально были известны только дрожжи верхового брожения, так как брожение всяких соков происходило при обычной температуре. Желая получить напит­ки, насыщенные СО 2 , человек стал вести брожение при низкой температуре. Под влиянием изменившихся внешних условий по­лучились дрожжи низового брожения с их свойствами, получив­шие широкое распространение.

Кроме общих свойств, дрожжи, используемые в том или ином производстве, обладают специфическими показателями. Более того, в одном и том же производстве применяются разновидно­сти, различающиеся одной или несколькими особенностями. Их выводят из одной клетки. Такие культуры называют расами (штаммами). Каждое производство располагает несколькими расами дрожжей.

Расы дрожжей спиртового производства

В спиртовом произ­водстве применяются те расы дрожжей верхового брожения, ко­торые обладают наибольшей энергией брожения, образуют мак­симум спирта и сбраживают моно- и дисахариды, а также часть декстринов. Из дрожжей, применяемых при получении спирта из хлебно-картофельного сырья, следует назвать расы ХП, М и ХV.

При переработке мелассы на спирт применяют расы Я, Л, В, Г-67, Г-73. Эти расы относятся к семейству Saccharomyces taceae, роду Saccharomyces, виду cerevisiae.

Раса ХП выделена в 1902 году из хлебопекарных прессованных дрожжей. Клетки дрожжей этой расы круглые ияйцевидные размерами 5-6,2 х 5-8 мкм.

Развитие и размножение дрож­жей расы ХП идет очень быстро. Они сбраживают глюкозу, фруктозу, сахарозу, галактозу, мальтозу, маннозу, рафинозу на одну треть и могут образовывать в сбраживаемой среде до 13%об спирта.

Раса М (Mischung – смесь), предложенная Геннебергом в 1905 году, состоит из смеси четырех рас дрожжей верхового бро­жения; она предназначена для сбраживания сред, содержащих смесь различных сахаров (декстринов, рафинозы), которые не­одинаково сбраживаются различными дрожжами. Такая смешанная культура очень устойчива против различных ненормаль­ных условий, встречающихся в заводской практике.

Раса ХV по технологическим признакам сходна с расой ХП. Ее применяют наряду с расой ХП для сбраживания смешанного зерно-мелассного сырья.

Из названных рас наиболее пригодной для сбраживания сусла из крахмалистого сырья является раса ХП, которая приме­няется также в гидролизном и сульфитноспиртовом производ­ствах. Правда, для сбраживания сульфитных щелоков выведены специально сульфитные дрожжи, сбраживающие глюкозу, фрук­тозу, галактозу и маннозу.

Дрожжи, применяемые на спиртовых заводах, перерабаты­вающих мелассу, должны обладать специфической способностью быстро сбраживать довольно концентрированные сахарные рас­творы и хорошо переносить высокое содержание солей в среде. Сбраживать же растворы, содержащие большие концентрации сахара, могут так называемые осмофильные дрожжи, которые выносят очень высокое осмотическое давление.

К таким дрож­жам относится раса Я, выведенная из мелассных дрожжей К.Ю. Якубовским. Раса Я обладает исключительной способностью сбраживать вы­сокие концентрации сахара и хорошо переносит высокое содер­жание солей и спирта в сбраживаемом мелассном сусле. Дрож­жи расы Я сбраживают глюкозу, фруктозу, сахарозу, галактозу, мальтозу; рафинозу сбраживают только частично и совершенно не сбраживают декстрины и лактозу. Раса Я относится к пыле­видным дрожжам верхового брожения.

Дрожжи расы Л (Лохвицкая) близки по своим свойствам к дрожжам расы Я, но они несколько лучше размножаются и более полно сбраживают сахар.

Раса В (венгерская) подобно расе Л приспособлена к мелассной среде. Эти расы хорошо сбраживают сахарозу, глюкозу, фруктозу, а рафинозу частично.

Дрожжи рас Л и В наряду с высокими бродильными свойствами обладают также хорошей подъемной силой (способностью поднимать тесто), что позволяет выделять их из бражки и выпускать в прессованном виде в качестве хле­бопекарных.

Успешное применение находят гибридные дрожжи, выведен­ные в Институте генетики АН СССР путем скрещивания двух видов дрожжей. Среди гибридов наибольший интерес представляют Г-67, Г-73. Гибрид 67 получен скрещиванием пивных дрож­жей S-carlsbergensis с S.cerevisiae расы Я. Дальнейшее скрещи­вание гибрида 67 с гибридом 26 (полученным от скрещивания рас Я и ХП) дало гибрид 73. Гибриды 67 и 73 наряду с дру­гими ферментами содержат α-галактозидазу и обладают способ­ностью к полному сбраживанию рафинозы. Рекомендованы к применению и другие гибридные дрожжи.

Расы хлебопекарных дрожжей

В дрожжевом производстве ценятся быстро размножающиеся расы дрожжей, обладающие хорошей подъемной силой и хорошей стойкостью при хранении. Вкус хлебопекарных дрожжей должен быть чистый, цвет белый или желтоватый. Подъемная сила определяется как особенно­стями рас дрожжей, так и способом ведения производства. Стойкость дрожжей является свойством расы, но зависит от внутреннего состояния клеток и чистоты дрожжей.

При производстве хлебопекарных дрожжей из мелассы при­меняются расы VII, 14, 28 и Г-176.

Раса VII, выведенная из прессованных товарных дрожжей Томского дрожжевого завода, быстро размножается и хорошо отпрессовывается до влажности 71-72%. Дрожжи расы VII обладают хорошей подъемной силой и наибольшей стойкостью при хранении по сравнению с други­ми известными в заводской практике. Кроме того, эта культура является устойчивой к вредным примесям, содержащимся в ме­лассе.

Раса 14 предназначена для произ­водства сухих дрожжей. Эти дрожжи отличаются плотной консистенцией при влажности 75%, высокой термоустойчи­востью.

Из гибридов хлебопекарных дрожжей отобран гибрид 176, обладающий всеми положительными признаками: крупными клетками (5,6-14,0 мкм), устойчивостью к вредным примесям мелассы и высо­ким коэффициентом размножения, который у этой расы выше, чем у наиболее быстро размножающейся расы 14. В настоящее время проходят производственные испытания и другие перспек­тивные гибридные расы дрожжей.

Расы пивных дрожжей

В пивоварении используют дрожжи низового брожения, приспособленные к сравнительно низким температурам. Пивные дрожжи должны быть микробиологиче­ски чистые, а также обладать способностью к хлопьеобразованию, быстро оседать на дно бродильного аппарата и давать прозрачный напиток с определенными вкусом и ароматом. К сильносбраживающим и легко дающим хлопья относятся пив­ные дрожжи низового брожения Фроберг (Saccharomyces cere­visiae Froberg), дрожжи рас V и 776.

На пивоваренных заводах большое распространение получили дрожжи расы 776, которая была выведена в начале XX в. Эти дрожжи считаются пригод­ными особенно для сбраживания сусла, приготовленного с добав­кой несоложеных материалов или из солода, полученного солодованием ячменей с невысокой степенью прорастаемости. Дрожжи расы 776 –среднесбраживающие, за период главного брожения на сусле концентрацией 11% образуют примерно 2,7% СО 2 . Клетки яйцевидной формы, длиной 8-10 мкм и ши­риной 5-6 мкм. Прирост дрожжевой массы 1: 5,4. Способность к осветлению удовлетворительная.

Из других дрожжей на пивоваренных заводах применяются расы 11, 41, 44, S-Львовская и др, различающиеся по бродиль­ной энергии, способности к осаждению и энергии роста.

Дрожжи расы 11 – сильносбраживающие, с хорошей способ­ностью к осветлению. Пиво, полученное с применением дрожжей расы 11, имеет хороший вкус. Эта раса получила широкое рас­пространение на пивоваренных заводах.

Дрожжи расы 41 – среднесбраживающие, с хорошей способ­ностью к осаждению. При сбраживании сусла расой 41 получа­ется мягкое пиво с чистым вкусом.

Дрожжи расы 44 – среднесбраживающие. Способность к осаждению хорошая. Сообщают пиву полноту вкуса и дают хорошие результаты при применении в производстве воды с по­вышенной жесткостью.

Дрожжи расы S – среднесбраживающие. Способность к осаждению хорошая. Дают пиво с мягким чистым вкусом.

Дрожжи расы Р – среднесбра­живающие, хорошо осветляют пиво и обусловливают приятный чистый вкус.

Дрожжи расы F характеризуются хо­рошей способностью к осветлению и сообщают пиву приятный аромат. Раса устойчива к действию посторонних микроорга­низмов.

Дрожжи расы А (выделены на рижском пивоваренном заво­де «Алдарис») сбраживают сусло за 7-8 суток, хорошо осветля­ют пиво и устойчивы к инфекции.

Путем разных способов селекции во ВНИИ пивобезалко­гольной промышленности получен ряд сильносбраживающих штаммов дрожжей (28, 48, 102), обладающих значительно боль­шей бродильной энергией, чем дрожжи исходной расы 11.

Пивные дрожжи верхового брожения находят широкое при­менение в Англии при приготовлении Портера. Они применяют­ся также для приготовления Берлинского светлого пива и дру­гих напитков. Для приготовления Бархатного пива применяют штамм 191 К, интенсивно сбраживающий моносахариды и маль­тозу, но не сбраживающий сахарозу, рафинозу и лактозу.

Расы винных дрожжей

В виноделии ценятся дрожжи, быст­ро размножающиеся, обладающие свойством подавлять другие виды дрожжей и микроорганизмы и придавать вину соответст­вующий букет. Дрожжи, применяемые в виноделии, относятся к своеобразному виду Saccharomyces ellipsoideus. Клетки их имеют продолговато-овальную форму. Дрожжи энергично сбра­живают глюкозу, фруктозу, сахарозу и мальтозу. В различных местностях и из различных молодых вин выделено несколько отличающихся одна от другой разновидностей или рас этого вида. В виноделии почти все производственные культуры дрож­жей – своего, местного происхождения. К их числу относятся расы Магарач 7, Массандра 3, Пино 14, Кахури и многие другие. Наряду с этими расами применяются и некоторые иностранные, например раса Штейнберг, выделенная в Германии в 1892 и 1893 гг., и раса Шампань-Аи.

Большая часть винных дрожжей относится к дрожжам низо­вого брожения.

Для приготовления белых столовых вин применяются расы Пино 14, Феодосия 1/19, Алиготе, Рислинг Анапский.

Раса Пино 14 имеет клетки яйцевидной формы, хорошо сбра­живает виноградное сусло сахаристостью 20 % с образованием 11,57%об спирта; оптимальная температура развития и бро­жения 18: -25°С. Эта раса является холодостойкой и кислото­стойкой; оптимальная величина рН 2,9-3,9.

Раса Феодосия 1/19 – крупноклеточная, пылевидная, очень энергичная, быстро сбраживает виноградное сусло и хорошо дображивает его; имеет широкий температурный диапазон бро­жения (от 9 до 35°С) и может применяться как холодостойкая и как термостойкая.

Дрожжей Алиготе имеется несколько рас, и все они сильные, с высокой энергией брожения. К энергично сбраживающим от­носятся и дрожжи Рислинг Анапский.

Для приготовления крепких вин применяется раса Массанд­ра 3 с яйцевидной формой клеток, пылевидная; оптимальная величина рН 3,7-4,05; оптимальная температура брожения 18-20°С. Виноградное сусло с содержанием сахара 20% сбраживается полностью; при сбраживании концентрированного виноградного сусла (30% сахара) образует 11,8%об спирта и оставляет несброженным 8,7% сахара.

Раса Магарач 125, названная в ознаменование 125-летнего юбилея первых посадок винограда в институте «Магарач», при­меняется для получения крепких и десертных вин. Эта раса хо­рошо сбраживает высококонцентрированные виноградные сусла с содержанием сахара 27-30%, холодостойкая.

Раса Кахури 2 широко применяется для приготовления шам­панских виноматериалов и вин. Виноградное сусло с содержанием сахара 20% она сбраживает с образованием 11,4%об спирта, оста­ется несброженным 0,28% сахара. Эта раса довольно холодо­стойкая (при температуре 14-15°С сусло забраживает на 2-й день) и сбраживает хорошо; оптимальная величина рН 3,4-3,6.

Раса Шампанская 7, применяемая для шампанизации вина в бутылках, выделена из расы Кахури 5 и характеризуется об­разованием трудно взмучивающегося осадка; интенсивно сбра­живает при температуре 4-9°С, хотя сусло и забраживает только на 5-6-й день.

Из винных дрожжей наиболее холодостойкой считается раса Ленинградская, а наиболее термостойкой – раса Ашхабадская 3.

В производстве хереса применяются специальные расы дрож­жей, которые являются разновидностью вида Saccharomyces oviformis. Хересные дрожжи образуют на поверхности вина в неполных бочках пленку, благодаря развитию которой вино приобретает особые букет и вкус.

Путем тщательного отбора по наиболее важным производст­венным признакам выделено несколько рас хересных дрожжей (13, 15 и 20) с высокой пленкообразующей способностью. В дальнейшем из производства, применявшего расу Херес 20, была отселекционирована более эффективная раса Херес 20-С, которая нашла широкое применение на многих заводах по про­изводству хереса.

В плодово-ягодном виноделии применяются селекционирован­ные расы дрожжей, выделенные из различных плодово-ягодных соков. Плодово-ягодные соки богаты дрожжами, обладающими всеми необходимыми для производства качествами и биологи­чески приспособленными к условиям развития в исходных пло­дово-ягодных соках. Поэтому штаммы дрожжей, выделенных из земляничных соков, применяются для сбраживания земляничных соков, а штаммы дрожжей, выделенных из вишневых соков, при­меняются для сбраживания вишневых соков и т. д.

В плодово-ягодном виноделии получили распространение следующие штаммы: яблочные 46, 58, клюквенный 17, смородиновый 16, брусничные 3, 7, 10, малино­вые 7/5, 25, 28, 28/10, вишневые 3, 6, земляничные 7, 4, 9.

Назван­ные штаммы дрожжей обеспечивают нормальный ход брожения, полноту сбраживания, быструю осветляемость и хорошие вкусо­вые качества вина; они сбраживают глюкозу, фруктозу, сахаро­зу, мальтозу, галактозу и не сбраживают лактозу и маннит.

Успешно применяются в плодово-ягодном виноделии расы дрожжей Москва 30, Яблочная 7, Вишневая 33, Черносмородиновая 7, Малиновая 10 и Сливовая 21. Чистая культура дрожжей Москва 30 рекомендуется для сбраживания клюквенного сусла; Яблочная 7 и Вишневая 33 – для сбраживания яблочного сус­ла; Черносмородиновая 7 и Вишневая 33 – для сбраживания черносмородинового и вишневого сусла.

4 Химизм спиртового брожения. Вторичные и побочные продукты спиртового брожения

Спиртовое брожение представляет собой цепь ферментатив­ных процессов, конечным результатом которых является распад гексозы с образованием спирта и СО 2 и доставка дрожжевой клетке той энергии, которая необходима для образования новых веществ, используемых для процессов жизнедеятельности, в том числе для роста и размножения. По химическому характеру спир­товое брожение – каталитический процесс, происходящий под действием биологических катализаторов – ферментов.

Современная теория спиртового брожения является резуль­татом работ многих ученых различных стран мира.

Для выяснения процессов брожения большое значение имели работы выдающихся отечественных ученых: Лебедева, Костычева, Фаворского, Иванова, Энгельгардта.

По современным представлениям, спиртвое брожение – это сложный непрерывный процесс распада сахара, катализируемый разными ферментами с образованием 12 промежуточных продуктов.

1 Начальной стадией превращения глюкозы является ре­акция фосфорилирования ее при участии фермента глюкозиназы. К молекуле глюкозы присоединяется фосфатный остаток от молекулы АТФ, которая находится в клетках дрож­жей, и образуется глюкозо-6-фосфат, а АТФ превращается в АДФ:

С 6 Н 12 О 6 + АТФ → СН 2 О(Н 2 РО 3)(СНОН) 4 СНО+АДФ

Глюкоза Глюкозо-6-фосфат

В результате присоединения фосфатного остатка от молеку­лы АТФ к глюкозе реакционная способность последней возра­стает.

2 Глюкозо-6-фосфат путем изомеризации под действием фермента глюкозофосфатизомеразы переходит обрати­мо в форму фруктозы:

СН 2 О(Н 2 РО 3)(СНОН) 4 СНО → СН 2 О(Н 2 РО 3)(СНОН) 3 СОСН 2 ОН

Глюкозо-6-фосфат Фруктозо-6-фосфат

СН 2 О(Н 2 РО 3)(СНОН)3СОСН 2 ОН + АТФ →

Фруктозо-6-фосфат

→ СН 2 О(Н 2 РО 3)(СНОН) 3 СОСН 2 О(Н 2 РО) + АДФ

Фруктозо-1,6-дифосфат

Эфиры глюкозо-6-фосфат и фруктозо-6-фосфат образуют равновесную смесь, получившую название эфира Эмдена и со­стоящую на 70-75% из эфира Робисона (глюкозы) и на 25% из эфира Нейберга (фруктозы).

Образованием фруктозо-1,6-дифосфата заканчивается подготовительная стадия спиртового брожения с переносом макроэргических фосфатных связей и с преобразованием гексозы в лабильную оксиформу, легко подвергающуюся дальнейшим фер­ментативным превращениям.

4 Следующим важнейшим этапом является десмолиз – разрыв углеродной цепи фруктозодифосфата с образованием двух
молекул фосфотриоз. Симметричное расположение остатков фосфорной кислоты по концам молекулы фруктозы облегчает разрыв ее углеродной цепи как раз в середине. Фруктозодифосфат распадается при этом на две триозы: фосфоглицериновый альдегид и фосфодиоксиацетон. Реакция катализируется фер­ментом альдолазой и обратима:

СН 2 О(Н 2 РО 3)(СНОН) 3 СОСН 2 О(Н 2 РО) → CH 2 О(Н 2 Р0 3)СОСН 2 ОН +

Фруктозо-1,6-дифосфат Фосфодиоксиацетон

СН 2 0 (Н 2 РОз) СНОНСНО (4)

З-фосфоглицериновый альдегид

Главная роль в дальнейших превращениях при спиртовом брожении принадлежит 3-фосфоглицериновому альдегиду, но в сбраживаемой жидкости он обнаруживается лишь в незначи­тельном количестве. Это объясняется взаимным переходом ке-тозного изомера в альдозный и обратно под действием фермента триозофосфатизомеразы (5.3.1.1)

СН 2 0 (Н 2 Р0 3) СОСН 2 ОН;£ СН 2 0 (Н 2 Р0 3) СНОНСНО

Фосфодиоксиацетон З-фосфоглицериновый альдегид

По мере дальнейшего превращения фосфоглицеринового аль­дегида новые количества его образуются в процессе изомериза­ции фосфодиоксиацетона.

5. Последующим этапом является окисление двух молекул З^фосфоглицеринового альдегида. Эта реакция катализируется триозофосфатдегидрогеназой (1.2.1.12), коферментом которой яв­ляется НАД (никотинамид-аденин-динуклеотид). В окислении участвует фосфорная кислота среды. Реакция протекает по сле­дующему уравнению: 2СН 2 0 (Н 2 Р0 3) СНОНСНО + 2Н 3 Р0 4 + 2НАД Триозофосфатдегидрогеназа ->

З-фосфоглицериновый альдегид

->- 2СН 2 0 (Н 2 Р0 3) СНОНСОО w (H 2 P0 3) + 2НАД

1,3-дифосфоглицериновая йислота

Молекула 3-фосфоглицеринового альдегида присоединяет фосфат, а водород переносится на кофермент НАД, который восстанавливается. Энергия, освобождающаяся в результате окисления 3-фосфоглицеринового альдегида, аккумулируется в макроэргической связи образующейся 1,3-дифосфоглицериновой

1,3-дифосфоглицериновая кислота 3-фосфоглицериновая кислота

7. Затем под действием фермента фосфоглицеромутазы
(2.7.5.3) остаток фосфорной кислоты перемещается от третьего
углерода ко второму, и в результате 3-фосфоглицериновая кис­
лота превращается в 2-фосфоглицериновую кислоту:

2СН 2 (Н 2 Р0 3) CHOHCOOH ^t 2CH 2 0HCH0 (Н 2 Р0 3) СООН. (7)

3-фосфоглицериновая кислота 2-фосфоглицериновая кислота

8. Следующей стадией является дефосфорилирование 2-фос-
фоглицериновой кислоты. При этом 2-фосфоглицериновая кис­
лота под действием фермента энолазы (4.2.1.11) путем дегидра­
тирования (потери воды) превращается в фосфоэнолпировино-
градную кислоту:

2СН 2 ОНСНО (Н 2 Р0 3) СООН qt 2СН 3: СО со (Н 2 Р0 3) СООН + 2Н 2 0. (8)

2-фосфоглицериновая кислота Сосфоэнолпировиноградная кислота

При этом превращении происходит перераспределение внут­римолекулярной энергии и большая ее часть аккумулируется в макроэргической фосфатной связи.

9. Весьма нестойкая фосфоэнолпировиноградная кислота
легко дефосфорилируется, при этом остаток фосфорной кислоты
под действием фермента пируваткиназы (2.7.1.40) передается
вместе с макроэргической связью молекуле АДФ. В результате
образуется более устойчивая кетоформа пировиноградной кисло­
ты, а АДФ превращается в АТФ:

2СН 2: СО сю (Н 2 Р0 3) СООН + 2АДФ -* 2СН 3 СОСООН + 2АТФ. (3)

Фосфоэнолпировиноградная Пировиноградная

кислота кислота

10. Пировиноградная кислота под действием фермента пи-
руватдекарбоксилазы (4.1.1.1) декарбоксилируется с отщепле­
нием С0 2 и образованием уксусного альдегида:

2CH 3 COCOOH -*2С0 2 + 2СН 3 СНО. (10)

Пировиноградная Уксусный альдегид

11. Уксусный альдегид при участии фермента алкогольдегид-
рогеназы (1.1.1.1) взаимодействует с НАД-Н 2 , образовавшимся
ранее при окислении фосфоглицеринового альдегида в фосфо-
глицериновую кислоту [см. уравнение (5)]. В результате уксус­
ный альдегид восстанавливается в этиловый спирт, а кофермент
НАД-Н 2 вновь регенерируется (окисляется в НАД):

2СН 3 СНО + 2НАД Н 2 Z 2СН 3 СН 2 ОН + 2НАД. (11)

Итак, завершающим этапом брожения является реакция восстановления уксусного альдегида в этиловый спирт.

Из рассмотренного цикла реакций спиртового брожения вид­но, что из каждой молекулы глюкозы образуется 2 молекулы спирта и 2 молекулы С0 2 .

В процессе спиртового брожения образуется четыре молеку­лы АТФ [см. уравнения (6) и (9)], но две из них затрачиваются на фосфорилирование гексоз [см. уравнения (1) и (3)]. Таким образом, запасается всего 2 г-моль АТФ.

Ранее указывалось, что на образование каждой грамм-моле­кулы АТФ из АДФ затрачивается 41,9 кДж, а в энергию двух молекул АТФ переходит соответственно 83,8 кДж. Следователь­но, при сбраживании 1 г-моль глюкозы дрожжи получают энер­гии около 84 кДж. В этом и заключается биологический смысл брожения. При полном расщеплении глюкозы на С0 2 и воду выделяет­ся 2874 кДж, а при окислении 1 г-моль глюкозы до С0 2 и Н 2 0 в процессе аэробного дыхания аккумулируется 2508 кДж, так как образующийся этиловый спирт еще сохраняет в себе потен­циальную энергию. Таким образом, с энергетической точки зре­ния брожение - процесс малоэкономичный.

Сбраживание отдельных Сахаров происходит в определенной последовательности, обусловленной скоростью их диффузии в дрожжевую клетку. Быстрее всех сбраживаются дрожжами глюкоза и фруктоза. Однако сахароза как таковая исчезает в сусле (инвертируется) еще в начале брожения. Она гидролизу-ется р-фруктофуранозидазой (3.2.1.26) оболочки дрожжевых клеток с образованием гексоз (глюкозы и фруктозы), которые легко используются клеткой. Когда в сусле почти не остается фруктозы и глюкозы, дрожжи начинают потреблять мальтозу.

§ 5. ВТОРИЧНЫЕ И ПОБОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ СПИРТОВОГО БРОЖЕНИЯ

Все вещества, получающиеся в результате сбраживания са­хара дрожжами, за исключением спирта и С0 2 , относятся к вто­ричным продуктам спиртового брожения. Кроме них, имеются побочные продукты спиртового брожения, которые образуются не из сахара, а из других веществ, находящихся в сбраживае­мом субстрате. К ним относятся амиловый, изоамиловый, изо-бутиловый и другие спирты, известные под названием сивушного масла.

Из вторичных продуктов спиртового брожения известны глицерин, уксусный альдегид, пировиноградная, уксусная, ян­тарная, лимонная и молочная кислоты, ацетоин (ацетилметил-карбинол), 2,3-бутиленгликоль и диацетил. В аэробных условиях пировиноградная кислота является также исходным веществом для цикла трикарбоновых кислот (цикла Кребса), по которому из нее образуются уксусная, лимонная, яблочная и янтарная кислоты. Высшие спирты образуются тоже из пировиноградной кислоты путем аминирования ее до аланина, который в свою очередь переаминируется в соответствующую кетокислоту. В ус­ловиях спиртового брожения кетокислоты, восстанавливаясь, образуют высшие спирты. Поэтому вторичные и побочные про­дукты спиртового брожения строго разграничить нельзя.

Уксусный альдегид может испытывать дисмутацию с обра­зованием уксусной кислоты и этилового спирта (реакция Кан-ниццаро):

СН 3 СОН + СН 3 СОН + Н 2 0 = СНзСООН + СН 3 СН 2 ОН.

Одна из молекул альдегида окисляется в кислоту, а другая восстанавливается в спирт. В щелочной среде одна молекула

уксусного альдегида вступает в окислительно-восстановитель­ную реакцию со второй молекулой уксусного альдегида; при этом образуются этиловый спирт, уксусная кислота и одновре­менно с ними глицерин, что выражается таким суммарным урав­нением:

2C 6 Hi 2 0 6 + Н 2 0 = 2СН 2 ОНСНОНСН 2 ОН + СН 3 СН 2 ОН + СН 3 СООН + 2С0 2 .

Глицерин образуется в небольшом количестве при спиртовом брожении. При изменении условий брожения его производство можно осуществить в промышленном масштабе.

Глицерин и уксусный альдегид являются промежуточными продуктами спиртового брожения. На последнем этапе нормаль­но протекающего процесса брожения происходит восстановле­ние значительной части уксусного альдегида в этанол. Но если уксусный альдегид связать сульфитом натрия, то направление спиртового брожения изменится в сторону образования больших количеств глицерина.

Удаление уксусного альдегида из сбраживаемой среды суль­фитом натрия представляется в следующем виде:

СН 3 СНО + Na 2 S0 3 + H 2 OW CH 3 CHONaHS0 2 + NaOH.

Уксусный альдегид, образовавшийся при декарбоксилирова-нии пировиноградной кислоты, в результате связывания суль­фитом не может служить акцептором водорода. Место уксусно­го альдегида занимает фосфодиоксиацетон, который получает водород от восстановленного НАД-Н 2 , образуя а-глицерофос-фат. Эта реакция катализируется ферментом глицерофосфатде-гидрогеназой. Под действием фосфатазы «-глицерофосфат де-фэсфорилируется, превращаясь в глицерин. Таким образом, в присутствии Na 2 S03 протекает глицерино-альдегидное броже­ние:

С 6 Н 12 0 6 = CH3CHO + СН 2 ОНСНОНСН 2 ОН + С0 2 .

Сахар Ацетальдегид Глицерин

С увеличением количества сульфита натрия, вводимого в сбраживаемую среду, соответственно увеличивается количество связанного альдегида и ослабляется образование этанола и С0 2 .

Образование кислот и ацетоина. Янтарная кислота образует­ся дегидрированием и конденсацией двух молекул уксусной кис­лоты с одной молекулой уксусного альдегида (гипотеза В. 3. Гва-ладзе и Женавуа):

2СН 3 С00Н + СН 3 СНО -* С00НСН 2 СН 2 С00Н + СН 3 СН 2 ОН.

В процессе спиртового брожения янтарная кислота образует­ся также дезаминированием глютаминовой кислоты. Акцепто­ром водорода в этой реакции является триозоглицериновый аль- Дегид, поэтому реакция дезаминированйя сопровождается одно­временным накоплением глицерина:

C 6 Hi 2 0 6 + COOHCH2CH2CHNH2COOH + 2Н 2 0 = СО0НСН 2 СН 2 С0ОН -Ь

Глюкоза Глютаминовая кислота Янтарная кислота

2СН 2 ОНСНОНСН 2 ОН 3 + NH 3 + С0 2 .

Глицерин

Амми>ак потребляется дрожжами на синтез белка, а глице­рин и янтарная кислота при этом выделяются в среду.

Образование лимонной кислоты, по Лафону, происходит из. девяти молекул уксусного альдегида:

9СН 3 СОН + 4Н 2 0 = (СН 2 СООН) 2 С (ОН) СООН + 6СН 3 СН 2 ОН.

Лимонная кислота

Образование молочной кислоты объясняют восстановлением пировиноградной кислоты:

СНзСОСООН + Н 2 -> СН 3 СН (ОН) СООН.

Пировиноградная Молочная кислота

Однако полагают более вероятным ее образование в резуль­тате гидролиза промежуточного продукта спиртового броже­ния - фосфоглицеринового альдегида:

СНОСНОНСН 2 ОР0 3 Н 2 + Н 2 0 -* СН 3 СН (ОН) СООН + Н 3 Р0 4 .

Фосфоглицериновьш Молочная кислота

альдегид

Конденсацией уксусной кислоты с ацетальдегидом объясня­ют образование ацетоина:

1) СНзСООН + СН 3 СНО->-СНзСОСОСНз + Н 2 0;

Диацетил

2) СН3СОСОСН3 + СНзСНО -4 СН3СОСНОНСН3 + СНзСООН.

Сначала образуется диацетил; затем путем дисмутации со-пряженного окисления-восстановления за счет воды диацетила с ацетальдегидом образуется ацетоин.

При восстановлении ацетоина образуется 2,3-бутиленгли-коль:

СН 3 СОСНОНСНз + НАД ■ Н 2 *± СН 3 СНОНСНОНСН 3 + НАД.

Механизм образования некоторых вторичных продуктов спиртового брожения еще не совсем ясен, однако не подлежит сомнению, что уксусный альдегид является основным исходным веществом для синтеза вторичных продуктов брожения.

Среди вторичных продуктов преобладают уксусная и янтар­ная кислоты, а также 2,3-бутиленгликоль и уксусны…

1. элевые, то есть верхового, теплого брожения;

2. лагерные, то есть низового, холодного брожения.

Такие названия закрепились за пивными дрожжами из-за того, что в процессе сбраживания дрожжи ведут себя по-разному и, соответственно, подразделяются на пылевидные и хлопьевидные. Частички пылевидных дрожжей всегда изолированы друг от друга, в связи с чем по окончании процесса брожения они остаются на поверхности бродильного сосуда. Частички дрожжей второго типа имеют хлопьевидный вид. Оболочки их клеток в процессе сбраживания склеиваются друг с другом, оседая при этом на дно сосуда, в котором происходит брожение.

Оба вида дрожжей состоят из микроскопических одноклеточных грибков. Первый содержит грибки, названные учеными Saccharomycetaceae cerevisiae, и используется при изготовлении берлинского светлого пива и многих сортов темного пива, в частности, портера. Так как темные сорта пива наиболее характерны для Великобритании, то дрожжи назвали элевыми, использовав название пива в стране. Этот тип дрожжей в процессе брожения при температуре порядка 14-25 градусов вначале образует на поверхности белую нежную пену, которая в течение некоторого времени темнеет, становится плотнее и образует как бы завитки коричневого цвета. Потом пена желтеет, а завитки распадаются. Некоторое количество клеток дрожжей выпадает в осадок, а те, что остались на поверхности, удаляются вместе с пеной. Второй тип дрожжей содержит грибки под названием Saccharomycetaceae carlsbergensis и наиболее эффективно работает при температуре порядка 6-10 градусов и ниже. Этот вид дрожжей сбраживает медленнее элевых, но зато их легко можно удалить, так как они выпадают в процессе брожения в осадок, почему и получили название низовых или лагерных по названию пива, для изготовления которого их и используют. Статистика продаж свидетельствует, что пиво, сваренное с участием дрожжей низового брожения, занимает примерно 90% мирового рынка.

Бродильная активность дрожжей характеризуется степенью сбраживания сусла, которая вычисляется с помощью определения цифрового значения отношения количества сброженного экстракта к количеству сухих веществ, присутствовавших в начальном сусле. Профессионалы классифицируют дрожжи по степени сбраживания следующим образом:

Высокосбраживающие со степенью сбраживания в пределах от 90 до 100%;

Среднесбраживаюшие - от 80 до 90%;

Низкосбраживающие - меньше 80%.

Полученные из одной клетки различные типы дрожжей называют штаммами или расами. На практике используется великое множество рас, каждой из которых присвоено собственное название или обозначение. Так, к высокосбраживающим расам относятся дрожжи следующих модификаций:

Раса 11, весьма нетребовательная к качеству сырья, используемого для приготовления пива, хорошо оседающая и позволяющая пиву приобрести полный вкус. Это единственный штамм, сразу же принимающийся за разложение мальтозы, в то время как другие штаммы вначале разлагают глюкозу;

Расы 34 и 308 известны высокой бродильной активностью, но чрезвычайно прихотливы относительно используемого для приготовления пива сырья;

Раса F (чешская) характеризуется способностью хорошо осветлять пиво, придавать ему приятный вкус и обладает устойчивостью к инфекциям и автолизу;

Раса 8аМ отличается высокой бродильной активностью, повышенным коэффициентом размножения и хорошей оседаемостью;

Раса Ф-2 может сбраживать низкомолекулярные декстрины и мальтотетрозу, тем самым глубоко выбраживая сусло;

Также в этом ряду следует назвать расы 4, 70, 129.

К среднесбраживающим расам относят следующие штаммы дрожжей:

Раса А (рижская) отлично осветляет пиво и устойчива к инфекциям;

Расы 41, Р (чешская) и S (львовская) хорошо оседают и придают пиву мягкий вкус;

Раса 44 чаще всего применяется при использовании жесткой воды;

Раса 776 применяется в случае использования несоложенных материалов;

Раса 131-К не может сбраживать лактозу, сахарозу и раффинозу, в связи с чем используется только при получении темных сортов пива, обладающих сладким вкусом.

Некоторые сорта пива изготавливаются с применением смеси различных штаммов дрожжей. Каждый отдельный штамм хранится в стерильной пробирке с некоторым количеством охмеленного сусло-агара, то есть раствора, созданного из литра пивного сусла и 18-20 грамм агара, при температуре +4 градуса. Практикой установлено, что для сбраживания 100 литров сусла требуется около полулитра дрожжей низового брожения. Зато при использовании дрожжей верхового брожения их потребуется вдвое меньше на то же количество сусла.

Химический состав различных штаммов также весьма разнообразен и характеризуется содержанием калия (на 100 г сухого вещества около 2400 мг), фосфора и кальция (около 200 мг), а также относительно небольшого количества магния, марганца и цинка. Содержание жидкости в составе дрожжей равняется примерно 75% от общего веса. Микроорганизмы, входящие в состав дрожжей, ученые относят к анаэробам, то есть жизнедеятельным при весьма малых количествах кислорода в их среде обитания. При размещении в кислородосодержащую среду, начинается их активное размножение. Если же их помещают в среду с низким содержанием кислорода, то микроорганизмы способствуют брожению, в результате которого выделяется спирт. Это свойство дрожжей и лежит в основе процесса варки пива. Таким образом, понимая роль дрожжей и учитывая особенности использования различных штаммов, можно варить пиво разного сорта, цвета и, самое главное, вкуса.

Атлас производственных спиртовых дрожжей Saccharomyces cerevisiae расы XII может служить справочным пособием для работников спиртовых заводов, обеспечивающих микробиологический контроль производства. В настоящее время при промышленном производстве продуктов питания с использованием дрожжей применяют, в основном, дрожжи вида Saccharomyces cerevisiae. При производстве хлеба, спирта, вина, хлебного кваса используют различные штаммы (расы) дрожжей. Даже сырье спиртовых заводов (зерно или меласса) влияет на выбор того или иного штамма. При производстве спирта из зерна чаще применяют дрожжи XII расы, постоянным местом обитания которых являются искусственно приготовляемые гидролизованные крахмалистые субстраты. Ведение технологии требует внимательного наблюдения за состоянием дрожжей и наличием посторонних микроорганизмов по участкам производства. Существующие методики позволяют проводить необходимый микроскопический анализ, но без определенной практики сложно идентифицировать полученные данные микроскопического анализа и регламентных показателей технологии.

Как известно, именно дрожжи превращают вещества зерна в этиловый спирт, и их можно рассматривать как одно из многочисленных орудий труда человека, а дрожжевую ферментацию - один из самых древних микробиологических процессов, используемых человеком в своих целях. Первое упоминание о применении дрожжей человеком относится к 6000 г. до нашей эры. Научное изучение дрожжей началось в 1680 г. после изобретения светового микроскопа. Исследователи различных стран описали внешний вид дрожжевых клеток; показали, что дрожжи - это живые организмы; доказали их роль при превращении сахара в спирт; получили чистые культуры дрожжей; классифицировали дрожжевые клетки по способу размножения, потреблению питательных веществ и внешнему виду. Современные оптические микроскопы оснащены сухими и иммерсионными объективами. Оптический микроскоп с сухим объективом позволяет изучать микроорганизмы размером более 5 мкм, иммерсионный микроскоп применяют при исследовании более мелких микроорганизмов. Изобретение электронного микроскопа позволило понять структуру дрожжевой клетки и изучить проявления её генетической системы, поскольку разрешающая способность электронного микроскопа 1,0-0,14 нм.

Микроскоп - незаменимый прибор при производстве спирта и без него невозможно эффективное ведение технологии: с его помощью определяют количество дрожжевых клеток в 1 мл дрожжевой или бродящей массы; процентное количество почкующихся и мертвых клеток; наличие посторонних микроорганизмов; содержание гликогена в клетках (упитанность клеток). Физиологическое состояние дрожжей устанавливают по внешнему виду клеток, что позволяет использовать дешевые световые микроскопы с сухими объективами. Следует отметить, что современное производство спирта не требует микроскопического анализа структуры дрожжевых клеток, однако при изучении внешнего вида клетки под световым микроскопом необходимо иметь представление и ее строении.

Строение дрожжевой клетки

Дрожжевые клетки имеют округлую или эллип­совидную форму с размером в поперечнике от 2,5 до 10 мкм и от 4,5 до 21 мкм в длину. На рис. 1 приведено графическое изображение среза дрож­жевой клетки. Клеточная стенка, клеточная мемб­рана, ядро, митохондрии, вакуоли - структуры клетки, видимые в световой микроскоп с сухим объективом при использовании специфических красителей.

Клеточная стенка представляет собой жесткую структуру толщиной 25 нм, составляет около 25% сухой массы клетки и состоит в основном из глюкана, манана, хитина и белка. Организация клеточ­ной стенки недостаточно изучена, однако совре­менные теории отдают предпочтение модели трех­слойной структуры, согласно которой внутренний глюкановый слои отделен от внешнего мананового промежуточным слоем с повышенным содержани­ем белка.

Клеточная мембрана (плазмалемма) дрожжевой клетки под электронным микроскопом выглядит как трехслойная структура, тесно прилегающая к внутренней поверхности клеточной стенки, и состоит примерно из равного количества липидов и белков, а также небольшого количества углеводов. Клеточ­ная мембрана выполняет роль барьера проницаемо­сти вокруг содержимого клетки и контролирует транспорт растворенных веществ внутрь клетки и из нее.

В изучении ядра достигнуты лишь некоторые успехи, поскольку индивидуальные хромосомы очень малы и не выявляются в виде дискретных структур ни в световом, ни в электронном микро­скопах. Дрожжевые клетки имеют одно ядро раз­мером от 2 до 20 мкм. Ядерная мембрана остается неизменной на протяжении всего клеточного цик­ла. Под электронным микроскопом она выглядит как двойная мембрана, усеянная порами.

Митохондрии - самые большие из клеточных включений сферической или цилиндрической формы размером в поперечнике от 0,2 до 2 мкм и от 0,5 до 7 мкм в длину. Двухслойная оболочка имеет толщину около 20 нм. Количество митохон­дрий в клетке более или менее постоянно и харак­терно для данного вида микроорганизмов.

Рис. 1. Графическое изображение среза дрожжевой клетки (в 1 сантиметре 1 микрометр)

Оно меняется в зависимости от стадии развития клет­ки и функциональной активности от 500 до 2000 тт. Функции митохондрий связаны с переносом электронов, ионов, субстратов внутри клетки. По­мимо этого в митохондриях синтезируются веще­ства, аккумулирующие химическую энергию клетки.

Зрелые дрожжевые клетки содержат большую вакуоль. При образовании почки вакуоль, по всей вероятности, дробится на более мелкие ва­куоли, которые распределяются между материн­ской клеткой и почкой. В дальнейшем эти маленькие вакуоли снова сливаются, образуя по одной вакуоли в материнской и дочерней клет­ках. Функция вакуоли точно не установлена. В ней содержатся гидролитические ферменты, по­лифосфаты, липиды, ионы металлов и др. Ваку­оль, возможно, выполняет функции резервуара для хранения питательных веществ и гидроли­тических ферментов.

Внутриклеточное содержимое дрожжевой клет­ки (за исключением ядра, митохондрий и вакуоли), как известно, называют цитоплазмой, состоящей из воды, липидов, углеводов, различных высокомолекулярных и низкомолекулярных соеди­нений, минеральных солей и др. Исследование клетки под электронным микроскопом показало сложную структуру цитоплазмы в виде гранул, функции и химические свойства которых достаточной мало не изучены. Цитоплазма играет важ­ную роль в биохимии клетки и находится в тесном взаимодействии с органеллами, которые она окру­жает.

Отличительная особенность популяции расту­щих дрожжевых клеток - наличие почек, образу­ющихся при делении клеток. Дочерняя клетка возникает в виде маленькой почки, которая рас­тет в течении большей части клеточного цикла. Рост дрожжей происходит в основном во время формирования почек, поэтому почка к моменту её отделения становится по размеру более или менее такой же, как зрелая клетка (см. рис. 2). Клетки могут разойтись вскоре после деления, однако часто ещё до их расхождения начинаются новые циклы клеточного деления, в результате чего образуются группы клеток. На месте отде­ления клеток друг от друга остаются следы, на­зываемые у материнской клетки дочерним шра­мом, а у дочерней клетки - родовым шрамом. На одном и том же месте клеточной стенки никогда не появляются две почки. Каждый раз почка ос­тавляет новый дочерний шрам на стенке мате­ринской клетки. По числу шрамов можно опре­делить, сколько почек образовала данная клетка, что позволяет оценить возраст клетки. Ус­тановлено, что у гаплоидных клеток насчитыва­ется максимально 18, а диплоидных - 32 почеч­ных шрама.

Рис. 2. Графическое изображение почкующейся клетки.

Методы световой микроскопии и микробиологического контроля, используемые в технологии спирта.

В технологии спирта при проведении микроскопического анализа популяции дрожжей световым микроскопом с сухим объективом рассматривают внешний вид клеток методом раздавленной капли в неокрашенном или окрашенном видах (прижиз­ненные препараты), производят подсчет общего количества клеток и процентного количества поч­кующихся клеток, определяют наличие посторон­них микроорганизмов.

Метод раздавленной капли

На предметное стекло наносят каплю исследуе­мой взвеси с дрожжевыми клетками, которую сверху накрывают покровным стеклом. Получен­ный образец рассматривают под микроскопом, где микроорганизмы видны в различных плоскостях. Данный метод прост, его применяют при изучении подвижности и внутреннего строения клеток мик­роорганизмов. Метод раздавленной капли без ис­пользования красителей позволяет различать дрожжевые клетки по толщине клеточных стенки и мембраны, состоянию цитоплазмы, наличию или отсутствию вакуолей, процентному количеству почкующихся и мертвых клеток, присутствию мо­лочнокислых бактерий.

Подсчет процентного количества почкующихся клеток

Для определения количества почкующихся кле­ток на предметное стекло наносят по одной капле дрожжевой суспензии без твердых включений и дистиллированной воды, закрывают покровным стеклом, излишек жидкости отбирают листком фильтровальной бумаги и микроскопируют. У зрелых дрожжей почкуется более 10% клеток.

Пример. Всего в 5 полях зрения обнаружено 33+35+29+32+30=159 дрожжевых клеток, в т. ч. почкующихся 4+5+3+5+3=20. Процентное количе­ство почкующихся клеток составляет 20 х 100/159 = 12,5 (%).

Измерение величин микроорганизмов

Единицей измерения величины микроорганиз­мов служит микрон (мкм), равный 0,001 милли­метра (мм). При измерении пользуются окуляр-микрометром - круглым стеклом с нанесенной на него шкалой (каждый миллиметр шкалы разделен на 10 делений). Стекло накладывают на диафрагму окуляра так, чтобы сторона с делениями оказалась вверху. Для тарирования значений одного деления окуляр-микрометра используют объект-микро­метр, который помещают на столик микроскопа и рассматривают как препарат. Объект-микрометр представляет собой стеклянную пластинку со шка­лой, одно деление которой равно 0,01 мм (или 10 мкм). На рис. 3 показано поле зрения микроскопа со шкалами окуляр-микрометра и объект микро­метра. По совпадению делений обоих шкал уста­навливают масштабный коэффициент для опреде­ления истинного значения одного деления окуляр-микрометра. На рисунке с делениями объект-мик­рометра совпали деления окуляр-микрометра №2 и №8, или 30 делений окуляр-микрометра совпали с 5 делениями объект микрометра (составляющими 50 мкм). Таким образом, одно деление окуляр-микрометра примерно равно 1,67 мкм (50/ 30=1,666...). Если вместо объект-микрометра на столик микроскопа поместить препарат с живыми дрожжами, можно определить их видимые разме­ры (длину и ширину), рассматривая препарат в те же объектив и окуляр и с тем же выдвижением ту­буса. Для этого необходимо установить, какому числу окулярных делений соответствует величина измеряемого объекта, и затем это число умножить на полученное значение масштабного ко­эффициента (в нашем случае равным 1,67 мкм). Полученные результаты измерений не поддаются математической обработке в соответствии с теори­ей эксперимента, однако они дают представление о размерах изучаемых микроорганизмов.

Подсчет количества клеток

Для подсчета количества дрожжевых клеток пользуется счетной камерой Горяева представляющей собой толстое предметное стекло с нанесенными на него поперечными прорезями. которые образуют три поперечно расположенные

Рис. 3. Шкалы объект-микрометра и объектив микрометра для измерения величин микроорганизмов под микроскопом

площадки. Средняя из них разделена на две части, на каждой из которых выгравирована сетка (см. рис. 5) площадью 9 мм 2 , разделенная на 225 больших квадратов площадью 0,04 мм 2 каждый (15 рядов по 15 квадратов) и 400 малых квадратов площадью 0,0025 мм 2 каждый (каждый третий ряд больших квадратов в горизонтальном и вертикаль­ном направлении разделен на 16 малых квадратов). Средняя площадка предметного стекла опущена на 0,1 мм относительно двух других площадок, на ко­торые накладывают специальное шлифованное по­кровное стекло размером 18x18 мм, что обеспечивает создание камеры для дрожжевой суспензии. Количество клеток определяют в соответствии с формулой О = А х К 1 х К 2 х В, где В количество клеток в 1 мл суспензии, шт/мл; А количество клеток в 80 малых квадратах, шт.; К., коэффици­ент глубины камеры (при глубине камеры 0.1 мм

Рис. 4. Камера Горяева: 1 - предметное стекло; 2 - специальное покровное стекло; 3 - камера для дрожжевой суспен­зии; 4, 6 - площадка для покровного стекла; 5 - сетка для подсчета дрожжевых клеток; 7 - прорезь для введения дрож­жевой суспензии

К 1 = 10; при глубине камеры 0,2 мм К 1 = 5); К 2 -коэффициент пересчета объема, 1/мл (К 2 = 5000 1/ мл); В - коэффициент разбавления пробы (для дрожжей В=10). При подсчете дрожжевых клеток в камере Горяева с глубиной 0,1 мм и десятикрат­ным разбавлением дрожжевой суспензии В = 5 х 10 4 А х В.

В зрелых дрожжах и сбраживаемом сусле (во время главного брожения) количество дрожжевых клеток превышает 80 млн шт/мл.

Подсчет процентного количества мёртвых клеток в дрожжевой суспензии

Для определения количества мёртвых клеток на предметное стекло наносят по одной капле не фильтрованной дрожжевой суспензии и ра­створа метиленовой сини (1:5000), окрашиваю­щей мертвые клетки в синий цвет. Каплю зак­рывают покровным стеклом, излишек жидкости собирают листком фильтровальной бумаги и че­рез 2 мин микроскопируют. В поле зрения мик­роскопа считают общее количество дрожжевых клеток, затем только синие, после чего препарат передвигают и подсчет ведут в новом поле зре­ния. Таким образом подсчитывают общее коли­чество клеток в пяти полях зрения. После подсчета вычисляют количество мертвых клеток в процентах. В зрелых дрожжах количество мёртвых клеток не должно превышать 1%. Пример. Всего в пяти полях зрения обнаружено 43+45+39+42-40=209 дрожжевых клеток, в т. ч. окрашенных в синий цвет 1 +0+0+0+1=2. Процентное количество мёрт­вых клеток составляет 2 х 100/209 = 0,96 (%).

Рис. 5. Сетка для подсчета дрожжевых клеток в камере Горяева: 1 - большой квадрат; 2 - малый квадрат

Определение содержания гликогена в дрожже­вых клетках

При нормальной технологии в дрожжах накап­ливается гликоген, когда 2/3 сахара сусла сброжены и дрожжи пригодны для использования в про­изводстве. Для определения количества гликогена в дрожжевых клетках на предметное стекло нано­сят каплю нефильтрованной дрожжевой суспензии и 2 капли 0,5%-ного раствора йода (0,5 г йода и 1 г KJ на 100 мл воды), капли смешивают, накрывают покровным стеклом, отбирают излишек жидкости листком фильтровальной бумаги и микроскопируют. При соотношении дрожжевой суспензии и ра­створа йода 1:2 через 2-3 мин клетки окрашивают­ся в светло-желтый цвет, а гликоген - в коричне­вый. Применять более крепкий раствор йода, чем 1%-ный, нельзя, так как он окрашивает в коричне­вый цвет не только гликоген, но и всю клетку. У зрелых дрожжей гликоген занимает от 1/3 до 2/3 клеток.

Определение бактериальной инфекции

Для определения процентного содержания бак­териальной инфекции (в первую очередь молочно­кислых бактерий) из пробы дрожжей берут одну каплю дрожжевой суспензии без твердых включе­ний и помещают ее на предметное стекло, куда до­бавляют одну каплю дистиллированной воды. Обе капли смешивают и накрывают предметным стек­лом, удаляя излишек жидкости листком фильтровальной бумаги, и микроскопируют. По­скольку производственные дрожжи ведут в нестерильных условиях по методу естественно чис­той культуры, то в них всегда можно обнаружить некоторое количество бактерий. При нормальной технологии в сернокислых дрожжах в поле зрения микроскопа (с объективом х40 и окуляром х7 и бо­лее) находят от 1 до 3 клеток бактерий, среди кото­рых обычно не бывает подвижных форм. Наличие в поле зрения микроскопа большего количества бактерий говорит о нарастании кислотности в про­изводственных дрожжах или в сбраживаемом сус­ле. Спороносные подвижные формы бактерий при закисании дрожжевого затора обычно не развива­ются вследствие накопления этилового спирта.

Внешний вид дрожжевых клеток

Покоящиеся дрожжи чистой культуры, моло­дые, зрелые, старые, голодающие и мертвые клетки можно определить по их размерам и форме, строению и внутреннему содержимому.

Размер и форма дрожжевых клеток

В среднем размеры клеток дрожжей расы XII составляют 6x9 мкм, однако в зависимости от ус­ловий среды, возраста и условий развития (кислот­ность, доступ кислорода и т.п.), их фактические размеры имеют отклонения в большую и меньшую стороны. Формы дрожжей одной расы определя­ются, в основном, условиями развития. Клетки им­еют овальную форму при культивировании на зер­новом сусле; при росте на твердой среде все расы дрожжей дают более или менее вытянутые клетки; несколько удлиненную форму имеют также дрож­жи в момент интенсивного развития.

Строение и внутреннее содержимое клетки

При микроскопическом анализе дрожжевых клеток следует обращать внимание на толщину оболочек; вид цитоплазмы; наличие в клетки ваку­олей и гликогена; количество в популяции мёртвых клеток. У молодых клеток толщина оболочки мало заметна, а у старых выступает в виде хорошо видимого ободка, который при дальнейшем старении становится двуконтурным. Вид цитоплазмы может быть однородный или зернистый. Зернистость большей частью характерна для старых, больных и развивавшихся в ненормальных условиях (высокая температура или перемена температур, высокая кислотность, инфекция) клетках. Отставание ци­топлазмы от оболочки клетки бывает при плазмо­лизе или свидетельствует о разрушении клетки. Количество гликогена в дрожжах непостоянно и зависит от их возраста. Наибольшее количество гликогена накапливается у зрелых дрожжей.

Вид дрожжевых клеток под объективом микроскопа в зависимости от их возраста

Внешний вид и содержи­мое клеток	Возраст дрожжевых клеток
	Покоящиеся (чистая культура)	Молодые (незрелые)	Зрелые	Перезрелые (старые)	Голодающие	Мертвые
	Овальная	Овальная	Овальная	Клетки съеживаются	Клетки съеживаются
Размер			Крупные	Уменьшаются в размерах	Уменьшаются в размерах
Почкующиеся клетки	Нет или единичные	Почкуется 10 %	Почкуется 10 %	Нет или единичные
Оболочка	Очень тонкая	Очень тонкая	Четко очерченная	Толстая или двуконтурная	Толстая или двуконтурная	Расплывается и распадается
Цитоплазма	однородная	Нежная и однородная	Неоднородная или зернистая	Сильно зернистая	Сильно зернистая	Комковатая
Вакуоли				Иногда занимает всю клетку
Гликоген	В единичных клетках	Занимает меньше 1/4 клетки или отсутствует	Занимает от 1/3 до 2/3 клетки	В небольших количествах	Отсутствует	Отсутствует

Вид дрожжевых клеток в зависимости от возраста

У молодых дрожжей оболочка очень тонкая, цитоплазма нежная и однородная. Вакуолей нет или видны малые вакуоли у небольшого количе­ства клеток. Гликоген в единичных клетках. Зрелые дрожжи имеют четко очерченные оболочки. За­метно 10-15% клеток с почками. В цитоплазме вид­на неоднородность, зернистость, появляются средние по величине вакуоли, в клетках содержится много гликогена. Количество мёртвых клеток не превышает 1%. У перезрелых дрожжей отчетливо видна толстая оболочка при сильной зернистости цитоплазмы. Большие вакуоли занимают почти всю клетку. Если дрожжам не хватало питательных ве­ществ, то клетки уменьшаются в размерах. Почку­ются единичные клетки. Процент мёртвых клеток по мере старения прогрессивно увеличивается.

Оболочки голодающих дрожжей толстые (у неко­торых клеток оболочки имеют переменную то­лщину), их содержимое зернисто. Клетки умень­шаются в размерах, съёживаются, немного удлиняются. Вакуоли отсутствуют, гликогена нет. Отми­рание и разрушение дрожжей происходит в не­сколько стадий. Цитоплазма становится комкова­той, но прилегает к хорошо видимой оболочке. За­тем оболочка расплывается и распадается. Прото­плазма становится ещё более зернистой и распада­ется на мелкие части. Иногда оболочка остаётся, но протоплазма отстаёт от неё, собирается комком в центре, клетка удлиняется, принимает непра­вильную форму и разрушается. В таблице приведе­ны данные о внешнем виде дрожжевых клеток в зависимости от их возраста.

Внешний вид дрожжевых клеток при дрожжегенерации

При пуске завода (при освоении производства, в начале сезона или при инфицировании оборудова­ния) дрожжи готовят из чистой культуры, поступа­ющей на завод в пробирке. Разведение чистой культуры производят путем последовательного пе­реноса клеток из пробирки в колбу емкостью 500 мл, затем в пятилитровую бутыль и маточник, от­куда дрожжи поступают в дрожжанку, где приго­тавливают производственные дрожжи.

Чистая культура дрожжей

На рис. 6 приведено изображение поля зрения микроскопа с дрожжевыми клетками, перенесен­ными из пробирки с чистой культурой в колбу с суслом. Оболочки клеток очень тонкие, цитоплаз­ма нежная и однородная, вакуолей нет. В поле зре­ния микроскопа нет молочнокислых бактерий, что говорит о хорошем качестве чистой культуры дрожжей. На рис. 7 дрожжи из колбы 500 мл после 24 ч роста. Тонкие оболочки, однородная цитоп­лазма клеток и отсутствие в ней вакуолей говорят о молодости дрожжей. Отсутствие молочнокислых бактерий в поле зрения микроскопа и большое ко­личество делящихся клеток (более 15%) ещё раз подтверждают хорошее качество чистой культуры.

Производственные дрожжи

Качество дрожжей перед передачей их в произ­водство определяют по количеству почкующихся клеток, наличию в дрожжах молочнокислых бак­терий, количеству мёртвых клеток, упитанности дрожжей (количество гликогена в клетках), коли­честву клеток в 1 мл дрожжей. На рис. 8-11 при­ведены изображения полей зрения микроскопа с пробами зрелых дрожжей из одной дрожжанки при определении их качества перед передачей в производство.

На всех изображениях крупные клетки овальной формы с четко очерченными оболочками и зернистой цитоплазмой. Почкуется более 10% клеток, а в поле зрения микроскопа не более 3 клеток молочнокислых бактерий (см. рис. 8). Количество мёртвых клеток не превышает 1% (см. рис. 9). Содержание гликогена говорит об упитанности дрожжей (см. рис. 10). Количество дрожжевых клеток составляет 120 млн. шт./мл (см. рис.-11). На основании проведенного анализа можно сделать только один вывод: дрожжи в дрожжанке хорошего качества и их можно передавать в производство.

В некоторых случаях происходит инфицирование дрожжей, в первую очередь молочнокислыми бактериями. На рис. 12 приведено изображение поля зрения микроскопа с пробами зрелых инфи­цированных дрожжей. Крупные клетки овальной формы с четко очерченными оболочками и зернис­той цитоплазмой. Почкуется значительное количе­ство клеток, однако в поле зрения микроскопа больше 3 клеток молочно кислых бактерий. Подоб­ные дрожжи не пригодны для использования в про­изводстве.

При остановке спиртовых заводов (отсутствие сбыта готовой продукции или капитальный ре­монт) дрожжи хранятся при температуре 10...12°С в течение нескольких месяцев. На рис. 13 приведе­но изображение поля зрения микроскопа с пробой захоложенных дрожжей из дрожжанки, которые хранились при температуре 7... 10 °С в течение 45 сут. Дрожжевые клетки различаются по размерам и форме. Одни клетки имеют овальную форму и гон­кие оболочки с однородной цитоплазмой, как мо­лодые или зрелые клетки. Другие клетки потеряли форму, оболочки толстые переменной толщины, цитоплазма сильно зернистая, что позволяет отнес­ти их к голодающим и перезрелым клеткам. Захоложенные дрожжи применяют в производстве. На рис. 14 приведено изображение поля зрения микро­скопа с пробой зрелых дрожжей из дрожжанки, при выращивании которых использовали захоложенные дрожжи. Клетки крупные, овальной формы, с четко очерченными оболочками и зернистой цитоплазмой. Некоторые клетки почкуются, коли­чество клеток молочнокислых бактерий не превышает нормы. Две клетки имеют разрушенные обо­лочки. По всей вероятности, это остатки клеток за­холоженных дрожжей. Дрожжи пригодны для ис­пользования в производстве.

Рис. 6. Чистая культура дрожжей

Рис. 7. Чистая культура дрожжей спустя 1 сутки

Рис. 8. Зрелые дрожжи из дрожжанки

Рис. 9. Зрелые дрожжи (подсчет процентного количества мертвых клеток)

Рис. 10. Зрелые дрожжи (определение упитанности дрожжей)

Рис. 11. Зрелые дрожжи (подсчет количество клеток в одном миллилитре дрожжей)

Рис. 12. Зрелые инфицированные дрожжи

Рис. 13. Зрелые дрожжи из дрожжанки после 45-суточного хранения при температуре 7.. .12 °С

Рис. 14. Зрелые дрожжи из дрожжанки, выращенные из захоложенных дрожжей

Внешний вид дрожжевых клеток при сбраживании сусла

При сбраживании сусла проведение микроскопического анализа целесообразно в случае нараста­ния титруемой кислотности бражки при брожении более чем на 0,2 °К (закисании бражки). На рис. 15 приведено изображения поля зрения микроскопа с пробой из закисшего бродильного чана (периоди­ческая схема сбраживания сусла, 72 ч брожения). Поскольку сбраживание сусла окончено, то анализ внешнего вида и внутреннего содержимого дрож­жевых клеток не дает результата. Большое количество молочнокислых бактерий в поле зрения мик­роскопа говорит о бактериальном закисании бродильного чана.

Рис. 15. Инфицированная бражка из бродильного чана

В настоящее время спиртовые заводы применя­ют несколько технологических схем производства спирта из зерна, отличающихся температурой теп­ловой обработки сырья: с использованием аппара­тов типа «Генц» - до 165 °С; агрегатов непрерыв­ного разваривания (Мичуринская схема) - до 150 °С; аппаратов гидродинамической обработки заме­са - до 95 °С. Помимо этого спиртовые заводы при­меняют различные осахаривающие материалы: солод; неочищенные ферментные препараты, получа­емые в условиях спиртового завода; очищенные ферментные препараты, производимые специализированными биохимическими заводами. Способы тепловой обработки замеса и исполь­зуемые ферментные препараты влияют на все технологические показатели, в т. ч. на показатели при­готовления дрожжей и сбраживания сусла. В атласе даны рекомендации по использованию микроско­пического анализа при производстве спирта из зер­на с применением аппаратов гидродинамической обработки замеса, очищенных ферментных препаратов и сернокислых дрожжей.

Инфицирование чистой культуры дрожжей

Микроскопический анализ пробы дрожжей из пробирки с чистой культурой или колбы после 20 ч роста показал наличие в полях зрения микроскопа молочнокислых бактерий. Чистая культура дрож­жей инфицирована (как правило, это происходит при длительном хранении в условиях высоких тем­ператур). Необходимо поменять чистую культуру дрожжей. При повторном выявлении инфекции в чистой культуре целесообразно поменять постав­щика чистой культуры дрожжей.

Инфицирование производственных дрожжей

Микроскопический анализ пробы зрелых дрож­жей из дрожжанки показал наличие в поле зрения микроскопа более 3 клеток молочнокислых бактерий, что говорит об инфицировании зрелых дрож­жей. Инфицирование дрожжей происходит в ре­зультате следующих основных причин: использо­вание некачественного зерна; применение воды из открытых водоемов (особенно в теплое время года); использование некачественных ферментных препаратов; некачественная мойка и стерилизация оборудования и трубопроводов; нарушения регла­ментных показателей приготовления дрожжей; эк­сплуатация устаревшего оборудования на заводе.

В себестоимости спирта стоимость зерна зани­мает 40-60% и использование дешевого зерна улучшает экономические показатели производ­ства. Однако при применении некачественного сы­рья возникают потери спирта в результате инфицирования. Целесообразно использовать зерно с ка­чеством не ниже первой степени дефектности: зер­но, вышедшее из стадии покоя; проявляющее уси­ленные физиологические процессы (дыхание), способствующие жизнедеятельности микроор­ганизмов; имеющее солодовый или гнилистый за­пахи, однако пригодное для производства. При не­обходимости переработки некачественного зерна температуру тепловой обработки замеса следует повысить до 130...135 °С.

При применении воды из открытых водоемов в теплое время года температуру тепловой обработ­ки замеса можно повысить до 130...135 °С. Пред­почтительно использовать воду питьевого качества из водопровода или артезианской скважины. Целе­сообразно применять способы обеззараживания воды или замеса путем их обработки магнитными и другими излучениями, используемыми в пище­вой и медицинской промышленностях при обра­ботке продуктов питания и медицинской техники.

Если не удается найти источник инфицирования зрелых дрожжей, то проверяют ферментные препа­раты на их бактериальную зараженность. В первую очередь инфицированными оказываются ферменты. производимые в условиях спиртовых заводов и нео­чищенные (в жидком виде) транспортируемые автомобильным или железнодорожным транспор­том (особенно в жаркое время года). При инфици­ровании ферментных препаратов их заменяют на качественные и меняют поставщика ферментов.

Мойку оборудования при дрожжегенерации осуществляют щетками и водой из шлангов (дав­ление 3-4 кг/см 2) с последующей стерилизацией паром. Расход пара составляет 10-12 кг на 1 м дрожжанки при 30-минутном пропаривании. Мой­ку трубопроводов проводят различными моечными растворами с последующей стерилизацией паром. Наиболее сложные для мойки и стерилизации внутренние змеевики. Змеевики охлаждения дрожжанок целесообразно заменить на рубашки охлаж­дения, а мойку внутренней поверхности проводить теплой водой поддавление 120-150 кт/см: с использованием очистителей высокого давления. Наибольший эффект от применения подобных очи­стителей достигается при мойке сварных стыковых и угловых швов внутри оборудования, а также при мойке внутренней поверхности дрожжанок с кор­розионными раковинами. Использование очистите­лей позволяет уменьшить расход пара и моющих растворов, а также исключить ручной труд при мойке внутренних поверхностей оборудования ще­тками.

Мойку и стерилизацию трубопроводов осуще­ствляют в соответствии с регламентом. Наиболее затруднительны мойка и стерилизация теплооб­менников типа «труба в трубе», охлаждающих осахаренную массу с 52...60 °С (в зависимости от ис­пользуемых ферментов) до 22...28 °С (в зависимос­ти от применяемых дрожжей), особенно если часто происходит остановка насосов, перекачивающих замес в осахариватель, что приводит к задержке массы в теплообменнике. Теплообменник типа «труба в трубе» целесообразно заменить на пластинчатый теплообменник, который в десятки раз меньше по габаритам, изготовлен из нержавеющей стали и его легко мыть в разобранном состоянии и стерилизовать.

При приготовлении дрожжей необходимо при­держиваться показателей технологического регла­мента. Наиболее трудно обеспечить подачу в змее­вики дрожжанок достаточного количества воды (особенно в теплое время года) и без задержек передавать зрелые дрожжи в бродильный чан. Замена охлаждающих змеевиков на рубашку охлаждения позволяет в несколько раз увеличить поверхность охлаждения дрожжанки и при нехватке холодной воды достичь охлаждения дрожжевой массы до не­обходимой температуры. Имея значительную по­верхность охлаждения в дрожжанках можно до­биться своевременной подачи дрожжей в броди­льный чан за счет изменения температуры дрожжегенерации. Снижение температуры дрожжегенерации до 25...27 °С обеспечивает увеличение сроков приготовления дрожжей, а увеличение температу­ры дрожжегенерации до 30...32 °С ускоряет приго­товление дрожжей.

В технологии спирта емкостное оборудование, как правило, изготавливают из черной стали с тол­щиной стенок 5-8 мм. Большая толщина стенок по­зволяет использовать дрожжанки и трубопроводы до 25 лет без ремонта. За это длительное время на стенках дрожжанок по различным причинам обра­зуются раковины (коррозия металла, кавитационные процессы в жидкости, усталость металла), которые плохо отмываются и способствуют инфицированию зрелых дрожжей. Необходимо вовремя менять оборудование (один раз в 6-7 лет эксплуа­тации) и, тем самым, исключать очаги инфицирования дрожжей.

Недостаточная упитанность дрожжевых клеток

Микроскопический анализ пробы зрелых дрож­жей из дрожжанки показал, что гликоген в клетках занимает менее 1/4 внутреннего содержимого, а клетки дрожжей уменьшились в размерах. Указан­ное говорит о том, что дрожжи или не дозрели и их рано передавать в производство или они перестоя­ли и клеткам необходимо дополнительное питание. В первом случае достаточно увеличить время дрожжегенерации. Во втором целесообразно про­верить продолжительность гидродинамической об­работки зернового замеса (полноту заполнения ап­парата гидродинамической обработки замеса в со­ответствии с регламентом), от чего зависит количе­ство растворимых сухих веществ сырья и, в осо­бенности, растворение белков зерна, поскольку не­достаток азотистого питания снижает бродильную активность дрожжей; правильность дозирования ферментов в осахаривателе. При недостатке азотистого питания можно, использовать карбомид, ко­торый учитывается и дозируется, исходя из содер­жания в нем азота.

Повышенное количество мертвых клеток

Микроскопический анализ пробы зрелых дрож­жей выявил, что содержание мёртвых клеток пре­вышает 1% от общего числа дрожжей. Сверхнор­мативное отмирание дрожжевых клеток происхо­дит при повышении температуры во время дрож­жегенерации выше регламентной (30 °С) или при повышении кислотности дрожжевого сусла (выше 1,1 °К). Целесообразно проконтролировать выпол­нение регламентных показателей дрожжегенера­ции.

Уменьшенное количество клеток в 1 мл дрожжей и недостаточное количество почкующихся клеток

Подсчет количества дрожжевых клеток под микроскопом показал, что их содержание в дрож­жах 80 млн шт/мл, а подсчет количества почкующихся клеток выявил, что в поле зрения микроскопа менее 10% почкующихся дрожжей. Необходимо проверить выполнение всех регламен­тных показателей, качество зерна, ферментов, сер­ной кислоты (определить наличие в ней мышьяка). Следует заменить некачественное сырьё и вспомо­гательные материалы.

Инфицирование сбраживаемого сусла

Микроскопический анализ пробы сбраживаемо­го сусла показал наличие большого количества мо­лочнокислых бактерий. Следует ожидать уменьшение выхода спирта из 1 тонны зерна, поскольку пита­тельные вещества сырья перерабатываются бакте­риями в молочную кислоту. Причинами инфицирования бражки могут быть: нарушение регламентных показателей при брожении; необоснованное увеличение времени сбраживания сусла, когда ко­личество несброженных углеводов в бражке со­ставляет менее 0,65 г/100 мл (при гидродинамичес­кой обработке замеса после 48-60 часов сбраживания), а бражка продолжает выдерживаться в бродильном чану до 72 часов; недостаток охлаждающей воды.

При нарушении регламентных показателей сбра­живания сусла и необоснованном увеличении вре­мени сбраживания достаточно провести организа­ционные мероприятия, обеспечивающие техноло­гическую дисциплину на предприятии. При недо­статке охлаждающей воды необходимо осуще­ствить технические мероприятия. Применение ру­башек охлаждения вместо змеевиков позволяет в несколько раз увеличить поверхность охлаждения бродильных чанов, что значительно снижает потребление воды. На заводах, применяющих для ох­лаждения бражки выносные теплообменники типа «труба в трубе», целесообразно заменить их на пластинчатые теплообменники, что позволит более эффективно охлаждать бражку не изменяя темпе­ратуру охлаждающей воды. Недостатки охлажда­ющей воды можно возместить снижением ее тем­пературы, путем внедрения градирен и холодиль­ных установок.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При производстве спирта основным компонен­том технологии служат дрожжи, требующие боль­шого внимания и ответственного отношения обслуживающего персонала, что возможно только при помощи микроскопического анализа как от­дельных клеток, так и дрожжевой популяции в це­лом. По внешнему виду клеток можно определить физиологическое состояние дрожжей и внести коррективы в технологию. Авторы считают, что приведенные в настоящем атласе изображения дрожжей под микроскопом облегчат работу обсл­живающего персонала спиртовых заводов при раз­ведении чистой культуры дрожжей, дрожжегенерации и сбраживании сусла.

Литература

1. ГУ 9182-160-00008064-98. Чистая культура дрожжей. Расса XII.

2. Павлович С.А. Медицинская микробиология. -Минск: Вышейшая школа, 1997. 133 с.

3. Яровенко и др. Технология спирта. -М.: Колос, 1996. 464 с.

4. Терновский Н^С. и др. Ресурсосберегающая технология в производстве спирта. -М.: Пи­щевая промышленность, 1994. 168 с.

5. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. -М.: Мир, 1987. 411 с.

6. Рухлядева А.П. и др. Инструкция по технохимическому и микробиологическому контро­лю спиртового производства. -М.: Агропромиздат, 1986. 399с.

7. Бачурин П.Я., Устинников Б.А. Оборудование для производства спирта и спиртопродуктов. -М.: Агропромиздат, 1985. 344 с.

8. Берри Д. Биология дрожжей. -М.: Мир, 1985. 95 с.

9. Коновалов С.А. Биохимия дрожжей. -М.: Пищевая промышленность, 1980. 272 с.

10. Селибер Г.Л. Большой практикум по микробиологии. -М.: Высшая школа, 1962. 420 с.

24 25 26 27 28 29 ..

ЧИСТЫЕ КУЛЬТУРЫ ВИННЫХ ДРОЖЖЕЙ

Различия между расами винных дрожжей.

Сбраживание стерильного виноградного сока в лабораторных условиях с применением дрожжей разных рас позволяет сравнивать их между собой. Давно известно, что расы винных дрожжей различаются по скорости размножения, скорости сбраживания сусла, сульфитостойкости, термо- и холодостойкости, кислотовыносливости, скорости осветления вина в связи с образованием пылевидных или хлопьевидных (конгломератных) осадков.

Чистые культуры дрожжей различаются и по спиртообразующей способности, определяемой по количеству образованного спирта при сбраживании сусла с повышенным содержанием сахара, и по спиртовыносливости, т. е. способности размножаться в винах с разной спиртуозностью.

Перечисленные свойства используются при выборе культуры дрожжей для сбраживания сусла в различных условиях. Так, в сусло, содержащее повышенное количество свободной сернистой кислоты (более 20 мг/л), рекомендуется вносить сульфитостойкие расы дрожжей; при низкой температуре сусла и окружающего воздуха (ниже 15°С) -холодостойкие культуры; при высокой температуре (выше 30°С) -термостойкие, при высокой кислотности (величина pH сусла ниже 3,0) - кислотовыносливые, при высоком содержании сахаров сусла (выше 22%) и необходимости полного сбраживания - расы дрожжей, обладающие высокой спиртообразующей способностью, для возобновления брожения вина - спиртовыносливые. При необходимости возможно большего контакта дрожжей со средой вносят расы дрожжей, образующие пылевидные осадки, а для бутылочной шампанизации для облегчения ремюажа и дегоржажа - расы дрожжей, образующие хлопьевидные осадки. Некоторые расы дрожжей с перечисленными выше свойствами приведены в табл. 27.

Установлены различия между винными дрожжами по пенообразующей способности. Показано, что расы дрожжей вида Sacch. uvarum сбраживают сусло без пены . Дрожжи этого вида накапливают повышенные количества глицерина и характеризуются холодостойкостью .

Кроме основного продукта брожения-этилового спирта - дрожжи-сахаромицеты накапливают вторичные и побочные продукты брожения в различных соотношениях. Многие из них уча-

ствуют в образовании аромата молодых вин. Сюда относятся высшие спирты, эфиры, жирные кислоты, альдегиды, диацетил и ряд других соединений.

Литературные данные, относящиеся к изучению образования высших спиртов при сбраживании виноградного сусла, свидетельствуют, что этот процесс зависит от состава сусла, степени его осветления, условий аэрации, стадии брожения и расы дрожжей. Проведенные нами определения показали, что разные расы винных дрожжей образовывали высших спиртов при сбраживании сусла от 80 до 500 мг/л. Наименьшее их количество было в вине при сбраживании сусла расой дрожжей Магарач 17-35 вида Sacch. oviformis и наибольшее - расой Яблочная 17 вида Sacch. vini. Культуры были рекомендованы для испытаний при приготовлении коньячных виноматериалов в Молдавии. Испытания показали целесообразность применения культур, образующих небольщие количества высших спиртов, для: получения 148 коньячных виноматериалов, так как высшие спирты при перегонке концентрируются. Виноматериал, полученный сбраживанием сусла на расе дрожжей Яблочная 17, был обогащен такими нежелательными компонентами, как изобутиловый, амиловый и изоамиловый спирты .

Образование летучих кислот, так же, как и высших спиртов, зависит от условий брожения и расы дрожжей. Количество летучих кислот колебалось в пределах 0,7-1,08 г/л при сбраживании сусла несколькими сотнями штаммов вида Sacch. ellipsoideus . Показано, что расы дрожжей образуют одинаковый набор летучих кислот (уксусную, пропионовую, изомасляную, масляную, изовалериановую, валериановую, капроновую, каприловую), но количества их различны. Содержание уксусной кислоты составляет около 90% от суммы летучих кислот. Расы дрожжей Туркестанская 36/5, Романешты 46, Яблочная 17 образуют на 0,4-0,5 г/л летучих кислот больше, чем Шампань Аи, Судак VI-5 вида Sacch. vini .

Состав фракций летучих сложных эфиров вин зависит от вида, расы дрожжей и условий брожения. Однако о роли отдельных эфиров в сложении вкусовых и ароматических свойств вина наши сведения еще недостаточны, кроме этилацетата, который легко обнаруживается органолептически и образуется в значительно больших количествах дрожжами пленчатыми и апикулятусами, чем сахаромицетами .

Н. И. Бурьян и сотр. получены сведения о различиях между расами дрожжей по образованию диацетила и ацетоина. Расы Ркацители 6, Ленинградская образуют их меньше, чем Ка-хури 7, Штейнберг 1892 г., Шампань Аи. Высказывается предположение, что присутствие в винах сниженных количеств высших спиртов, ацетоина, диацетила и незначительных количеств высококипящих летучих кислот будет играть положительную роль в образовании аромата вин.

Установлены различия между расами дрожжей по способности образовывать пировиноградную и а-кетоглутаровую кислоты, которые связывают свободную сернистую кислоту и снижают ее антисептическое действие . Показано, что некоторые штаммы дрожжей могут образовывать при брожении сероводород из H2SO3 и элементарной серы и придавать вину сероводородный тон. В Австралии проведена селекция рас дрожжей, не образующих сероводорода даже в присутствии элементарной серы, попадающей в сусло с ягод винограда, обработанных серой. Сообщается о резком снижении сероводородного тона в винах в результате применения отселекционированных рас дрожжей .

Появились работы, в которых сообщается о различиях между расами винных дрожжей по потреблению яблочной кислоты в процессе брожения сусла . Некоторые расы дрожжей способны разлагать почти половину яблочной кислоты, а другие-- очень немного . Вероятно, можно будет отобрать расыдрожжей с минимальной способностью поглощения яблочной кислоты и использовать их для сбраживания низкокислотных сусел и, наоборот, расы дрожжей с максимальным потреблением яблочной кислоты, которые будут снижать кислотность при брожении высококислотных сусел.

Определение активности ферментов пектинрасщепляющего комплекса у 292 рас дрожжей-сахаромицетов показало, что они различаются по активности пектинэстеразы и полигалактуроназы, т. е. по способности расщеплять пектиновые вещества .

Появилось сообщение о том, что замечена разница между расами дрожжей по фиксации пигментов. Возможно, это свойство будет учитываться при отборе рас дрожжей для виноделия по красному . В настоящее время для приготовления красных вин рекомендуются культуры, выделенные из красных вин, имеющие названия Бордо, Каберне 5 и др.

Ассимиляция аминокислот дрожжами из среды происходит сложными биосинтетическими путями, включая переаминирование. Исследование некоторых трансаминаз показало, что расы винных дрожжей обладают разной активностью этих ферментов и она остается достаточно высокой у некоторых культур при выдержке вина на дрожжевом осадке. Ферментные концентраты, приготовленные из разных рас винных дрожжей, различаются по содержанию в них аминокислот и витаминов группы В, в связи с чем возможно индивидуальное воздействие того или иного ферментного концентрата на качество вина. Для получения ферментных концентратов рекомендуется раса Феодосия 1-19 .

Показано, что на размножение молочнокислых бактерий, вызывающих яблочно-молочное брожение, влияет штамм дрожжей, на котором проходит спиртовое брожение. Высказано предположение, что штаммы дрожжей могут выделять стимуляторы и ингибиторы размножения молочнокислых бактерий .

Установлена связь между спиртовыносливостью рас дрожжей, их выживаемостью и образованием больших количеств альдегидов при выдерживании виноматериалов на дрожжевых осадках в условиях ограниченного доступа воздуха к виноматериалу. Для накопления альдегидов при получении хереса беспленочным методом рекомендуется проводить сбраживание сусла и последующую выдержку вина на спиртовыносливых расах дрожжей вида Sacch. oviformis. К числу таких рас относятся Мага-рач 17-35, Ленинградская, Киевская.

Недавно получены данные о существовании антагонистических отношений между культурами дрожжей-сахаромицетов. Оказалось, что все они принадлежат к одному из трех фенотипов: убийца или киллер (killer - К), нейтральный (neutral - N), чувствительный (sensitive - 5). Киллеры вызывают гибель чувствительных культур при совместном развитии в виноградном сусле. Дрожжи, имеющие фенотип нейтральных, не убивают чувствительные и не погибают от действия киллеров. В связи с

тем что виноградное сусло, поступающее на брожение, нестерильно и содержит дрожжи разных фенотипов (К, N, S), целесообразнее для обеспечения брожения сусла на чистых культурах дрожжей вводить в него разводки более конкурентоспособных рас фенотипов К или N . Среди культур, имеющихся в коллекции дрожжей ВНИИВиВ «Магарач», такими свойствами обладают расы 47-/С и 5-N вида Sacch. vini, которые к тому же являются сульфитостойкими, что делает их еще более конкурентоспособными и позволяет им быстрее размножаться в сусле после его отстаивания с сульфитацией.

Для сбраживания пивного сусла употребляются дрожжи верхового и низового брожения, размножающиеся почкованием. Эти дрожжи относятся к семейству сумчатых грибков - эндомицетов и входят в группу сахаромицетов.

Сбраживание сусла дрожжами верхового брожения имеет весьма характерные внешние признаки. Верховые дрожжи во время брожения поднимаются кверху и образуют шапку пены. К концу брожения часть дрожжей садится на дно чана.

Бродильная способность верховых дрожжей отличается тем, что большинство их совершенно не сбраживает раффинозу и лишь некоторые виды могут сбраживать раффинозу только на одну треть.

Низовые дрожжи во время брожения всегда садятся на дно и не образуют шапки на поверхности бродящего сусла. Но своей бродильной способности они отличаются от верховых дрожжей тем. что полностью сбраживают раффинозу.

В пивоварении наиболее широко применяются дрожжи низового брожения. Дрожжи верхового брожения употребляют значительно реже, главным образом для темных или специальных сортов пива.

Для специальных сортов пива, например английского портера, применяются также дрожжевые грибки, относящиеся к семейству торул (из рода слабобродящих бретаномицетов). Эти группы торул придают пиву особый своеобразный аромат. Они вводятся в пиво не в начале брожения, а в конце, перед выдержкой пива в лагерных подвалах.

Низовые дрожжи, применяемые в пивоварении, подразделяются на расы, отличающиеся по характеру роста на питательных средах (колонии), размеру и форме клеток, степени сбраживания сахаров, образованию ароматических веществ и т. д.

Все низовые дрожжи сбраживают глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, раффинозу, не сбраживают инулин, лактозу и декстрины. Верховые дрожжи легко образуют споры, низовые же значительно труднее, а у некоторых рас пивных дрожжей вовсе не удается получить спорообразования.

Дрожжевые клетки низовых и верховых дрожжей имеют в большинстве случаев овальную форму. Форма клеток довольно изменчива; изменчив также в широких пределах и размер клетки. Поэтому в одной и той же чистой культуре дрожжей можно встретить то более круглые, то более вытянутые клетки.

Размеры клеток в разных культурах дрожжей колеблются от 6-8 до 12 мк по большему и меньшему диаметру клетки.

В клетках пивных дрожжей, как и всех других, различаются отчетливо выраженные оболочка, протоплазма с различными органическими включениями, больших или меньших размеров вакуоли и ядро.

Ядро в дрожжевой клетке обычно видно при специальных методах окрашивания. Оно имеет изменчивую форму, при почковании делится, и отделившаяся половина переходит в почку, из которой формуется новая, дочерняя дрожжевая клетка. При спорообразовании ядро клетки делится на столько частей, сколько спор образуется в клетке.

Морфологическое строение клетки зависит от ее физиологического состояния. Голодающие клетки, находящиеся в осадках, имеют зернистое строение протоплазмы и кажутся съежившимися. В мертвых клетках протоплазма отстает от оболочки, сами клетки кажутся сморщенными и имеют явно неправильное очертание оболочки. Такие клетки легко и интенсивно окрашиваются красками, например метиленовой синью. Молодые, только что отпочковавшиеся клетки имеют более нежную, тонкую протоплазму, в некоторых местах которой видны более темные, сильно преломляющие свет включения - жировые капельки, волютин и другие включения запасных питательных веществ. По мере старения клеток в них появляются больше включений и более выраженная зернистость протоплазмы, вакуоль также становится более заметной и большего размера.

Различное морфологическое строение клеток в зависимости от физиологического состояния дрожжей является одним из показателей, по которым можно при известном навыке судить ѳ благоприятных или неблагоприятных условиях брожения сусла.

Наиболее распространенной расой низовых дрожжей в пивоваренном производстве СССР была раса 776.

За последние годы широкое распространение получили также расы 11 и 47, выведенные Центральной научно-исследовательской лабораторией бродильной промышленности РСФСР.

Низовые пивные дрожжи обладают свойством во время брожения, и особенно в конце его, образовывать хлопья, состоящие из массы отдельных клеток, как бы склеенных между собой. Эта способность дрожжей (хлопьевидность) имеет весьма важное практическое значение. Благодаря хлопьевидности пивных дрожжей достигается быстрое осветление пива и создается полная возможность собирать дрожжи из бродильных чанов, не прибегая к сепарированию, и вновь использовать их для последующих циклов брожения.

Хлопьевидность дрожжей зависит от свойств оболочек дрожжей и также, по-видимому, от электрического заряда клеток. Она легко нарушается при изменении концентрации водородных ионов. В слабощелочной среде хлопьевидные дрожжи становятся пылевидными, но особенно сильно изменяется хлопьевидности дрожжей в кислой среде.

Наибольшая хлопьевидное™ дрожжей наблюдается в среде при pH 4,0-4,4. При большем подкислении среды дрожжи становятся пылевидными.

На характер хлопьеобразования дрожжей большое влияние оказывает температура брожения. При более высокой температуре хлопьеобразование менее выражено, чем при низких температурах.

На скорость оседания дрожжей известное влияние оказывает также упитанность дрожжей и их плотность. В этом отношении низовые дрожжи также выгодно отличаются от верховых, более легких дрожжей.

Оптимальная температура для роста низовых дрожжей около 25-27°С, минимальная - около 2-3°С. Низовые дрожжи хорошо переносят низкую температуру при хранении; при длительном хранении в этих условиях они приспосабливаются и значительно повышают бродильную энергию.

Дрожжи низового брожения при температуре 60-65ºC отмирают. Это имеет важное значение при пастеризации пива. Оптимальной температурой брожения в производстве обычно считается от 8 до 10ºC, хотя при более высокой температуре (10-14°С) может быть достигнута наибольшая интенсивность брожения.

На низовые дрожжи оказывает сильное угнетающее действие ряд веществ. При содержании этилового спирта в среде выше 1,5% замедляется размножение дрожжей, а при содержании спирта выше 3% заметно ослабевает их бродильная способность. Кислоты действуют угнетающе в значительно меньших концентрациях, причем минеральные кислоты действуют сильнее органических. Серная кислота в концентрации 0,5% убивает дрожжи в течение 1-2 ч. Из органических кислот молочная кислота в концентрации до I % легко переносится дрожжами. Сильное действие на дрожжи оказывает уксусная кислота. В концентрации 0,5% она резко угнетает, а в концентрации 1% убивает дрожжи в короткий срок.

Самая слабая органическая угольная кислота (Н2СО3) также угнетает развитие дрожжей. Это угнетающее влияние углекислоты при концентрации ее в среде до 0,2% сказывается главным образом на замедлении почкования дрожжей. Более высокая концентрация угнетает и бродильную способность дрожжей. Концентрация углекислоты 1,5%, достигаемая при избыточном давлении CO2 9-10 атм, останавливает брожение, но не убивает дрожжей.

Угнетающее действие угольной кислоты связано с торможением реакции расщепления пировиноградной кислоты на ацетальдегид и углекислоту (см. приведенную выше схему брожения).

Ацетальдегид, как и формалин, оказывает на дрожжевые клетки сильное угнетающее действие при относительно низких концентрациях, но более высоких, чем это встречается в нормальных условиях брожения.

Высшие спирты, в том числе и образуемые дрожжами при брожении, входящие в состав сивушного масла, ядовиты для дрожжевых клеток. Но в тех концентрациях, которые встречаются в бродящем пиве, заметного влияния на бродильную энергию не оказывают. Однако если искусственно создать такую концентрацию высшего спирта в среде до начала брожения, то может затормозиться или полностью остановиться процесс размножения и почкования дрожжей.

Ультрафиолетовые лучи обладают сильным действием и довольно быстро убивают дрожжи.

От свойства дрожжей зависят осветление пива во время брожения, степень сбраживания и скорость процесса брожения, а также аромат и вкус пива.

По способности обусловливать аромат и вкус пива дрожжи довольно резко отличаются друг от друга, хотя и не удалось еще химико-аналитическими методами установить различие, вызываемое ими в составе пива. Известно сейчас только одно, что эти различия зависят от продуктов обмена веществ у дрожжей, которые не удается определить химически, по всей вероятности, из-за крайне малых количеств этих продуктов.

Для производства пива наиболее ценны такие дрожжи, которые глубоко и быстро сбраживают экстракт сусла, дают сильное II полное осветление, образуют ярко выраженный аромат и мягкий вкус пива.

Однако такие качества дрожжей не совмещаются в какой- либо одной расе. Поэтому в производстве начинают широко применять смешанные расы дрожжей или ведут брожение на разных расах с последующим смешиванием пива после главного брожения. Для смешанных рас подбирают дрожжи с одинаковой скоростью размножения: одни с более выраженной бродильной способностью, а другие - дающие более тонкий аромат. Но при всех условиях смешиваемые расы дрожжей должны обладать примерно одинаково выраженной хлопьевидностью.

Все сказанное относится к культурным дрожжам. Кроме них, в производстве, как спутники и вредители, встречаются так называемые дикие дрожжи. Они могут относиться к тому же семейству зндомицетов и входить в группу сахаромицетов, как и культурные пивные дрожжи. Нередко на производстве встречаются дикие дрожжи, относящиеся и к другим семействам.

Из сахаромицетов встречаются дрожжи Saccharomyces еllі рsoideus, Saccharomyces pasteurianus, Saccharomyces apiculatus и др. Они обладают очень слабой энергией брожения, образуют не более 1% спирта. Многие из них бывают причиной постороннего запаха (затхлый, запах сельдерея) и вкуса пива.

К вредителям производства относятся также дикие пленчатые дрожжи (Mycoderma). Они преимущественно развиваются на поверхности сусла и пива в виде пленки, образуют вещества, придающие пиву неприятный вкус и запах, спирт окисляют до уксусной и угольной кислоты.

Большинство диких дрожжей нуждается в кислороде и довольно плохо развивается при температуре ниже 10°С. Поэтому предупредительные меры, предохраняющие производство от развития диких дрожжей, сводятся к соблюдению чистоты, ведению брожения при низкой температуре, уменьшению поверхности соприкосновения сусла и бродящего пива с воздухом.